在分光光度計(jì)中,將不同波長的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液時(shí),便可得到與眾不同波長相對應(yīng)的吸收強(qiáng)度.如以波長(λ)為橫坐標(biāo),吸收強(qiáng)度(A)為縱坐標(biāo),就可繪出該物質(zhì)的吸收光譜曲線.利用該曲線進(jìn)行物質(zhì)定性、定量的分析方法,稱為分光光度法,也稱為吸收光譜法.用紫外光源測定無色物質(zhì)的方法,稱為紫外分光光度法;用可見光光源測定有色物質(zhì)的方法,稱為可見光光度法.它們與比色法一樣,都以Beer-Lambert定律為基礎(chǔ).

    近年來,紫外及可見光分光光度分析已得到廣泛的應(yīng)用,它不僅可以用于物質(zhì)的鑒定及結(jié)構(gòu)分析,而且還可以用于某些物質(zhì)含量的測定.

分光光譜技術(shù)可用于:

• 通過測定某種物質(zhì)吸收或發(fā)射光譜來確定該物質(zhì)的組成。
• 通過測量適當(dāng)波長的信號強(qiáng)度確定某種單獨(dú)存在或與其他物質(zhì)混合存在的一種物質(zhì)的含量。
• 通過測量某一種底物消失或產(chǎn)物出現(xiàn)的量同時(shí)間的關(guān)系,追蹤反應(yīng)過程。

一、紫外及可見光分光光度法這是一種只在可見光及紫外光光譜應(yīng)用范圍內(nèi)測量物質(zhì)吸收放射線的技術(shù),應(yīng)用十分廣泛.其中分光光度計(jì)可用于測量特定波長的吸收值,而比色計(jì)則是一種較簡單的測量儀器,其原理是利用慮光片來測量較寬波段(如可見光中的綠光、紅光或藍(lán)光范圍)的吸收值.

光吸收法則:

溶液對光的吸收有兩個基本法則:

①透過溶液的光的吸收值同吸收溶質(zhì)的分子數(shù)目(即溶質(zhì)濃度[C])呈指數(shù)相關(guān)。

②透過溶液的光的吸收值同透過吸收溶液的路徑長度l成指數(shù)相關(guān)。

這兩條法則包括在比爾-朗伯關(guān)系式中.通常以入射光(Io)和出射光(I)的光密度來表示:

   ε其中ε對于吸收物質(zhì)及波長是一個常數(shù),稱為吸光系數(shù)或吸收系數(shù),[C]的單位為mol/L或g/L,l的單位為ml.這一公式非常有用,因?yàn)榇蠖鄶?shù)分光光度計(jì)設(shè)計(jì)為直接測量log10(Io/I)的值(A)或消光值(E)(舊教材中可能使用以廢除的術(shù)語:光密度).對于遵循比爾-朗伯關(guān)系的物質(zhì),A與C呈線性關(guān)系.吸收值常用下標(biāo)表示其波長,如A550表示550nm處的吸收值.透過溶液的光的比例稱為透光率(T),可由出射光和入射光的比值求得.

吸收值(A)(absorbance)--由公式得出:

    透光率(T)(transmittance)--通常以百分?jǐn)?shù)表示:T=(I/Io)×(一)比色計(jì)比色計(jì)用于測定顏色明顯,并且是溶液主要組分的待測物,如血液中的血紅細(xì)胞,也可以在待測物之中加入一種試劑,使其形成有色產(chǎn)物(一種生色團(tuán)),如用茚三酮法測定氨基酸含量.定量分析某種物質(zhì)要做標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線是在測定待測樣品的同時(shí)測定已知含量的物質(zhì)來制成的,而不是使用比爾-朗伯關(guān)系.

    光源通常為鎢絲燈泡,通過一個凸透鏡聚焦后產(chǎn)生一束平行光,平行光穿過裝有溶液的玻璃樣品或小池,然后透過一個有色濾光片到達(dá)光電管檢測儀,檢測儀產(chǎn)生一個同落在光電管上的光密度成正比的電勢,來自于光電管的信號被放大然后傳遞到電流計(jì)或數(shù)字讀數(shù)器.

比色計(jì)的使用:

①接通電源使儀器穩(wěn)定,使用前至少要讓燈預(yù)熱5min；

② 選擇一種同底物顏色互補(bǔ)的濾光器；

③調(diào)零(用空白對照調(diào)零)；

④調(diào)整靈敏度；

⑤分析樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液；

⑥由于不同比色杯的吸光特性、杯壁厚度不同,因此為了提高度,同一試驗(yàn)應(yīng)用同一比色杯,且在比色槽中擺放的方位相同；

⑦每次測樣前清洗比色杯；

⑧經(jīng)常重復(fù)測定同一溶液檢驗(yàn)比色計(jì)的可重復(fù)性；

⑨用標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

     由于大多數(shù)過濾器過濾出來的光的波帶很寬,因而比色計(jì)既不能用于確定某種復(fù)合物,也無法分辨在混合液中吸收特性非常相近的兩種物質(zhì).比色計(jì)所用光電管的變化系數(shù)為0.5%左右,因而不適合要求具有高度性的工作.使用這種zui簡單的儀器,由于儀表上對數(shù)測量刻度單位的隨意性,即使是把表上的靈敏度/刻度調(diào)節(jié)到零控點(diǎn),在一個儀器上獲得的值不可直接同另一臺儀器上測得的值相比較,同一儀器的不同設(shè)置之間也不可直接比較.比色計(jì)對于特定波長的量化工作是不合適的.

(二)紫外光/可見光分光光度計(jì)紫外光/可見光分光光度計(jì)基本裝置中采用高強(qiáng)度的鎢燈作為光源,能夠在可見光范圍(400~700nm)調(diào)節(jié).氘燈用于紫外分光光度測量(200~400nm);使用氘燈時(shí)要用石英杯,因?yàn)樽贤饩€不能透過玻璃.

    分光光度計(jì)之所以優(yōu)于比色計(jì)就在于使用了一個衍射光柵將光源的復(fù)色光轉(zhuǎn)換為單色平行光束.實(shí)際上從這種單色一種產(chǎn)生的光不是某個波長的光,而是一段窄的帶寬上的光,帶寬是分光光度計(jì)的一個重要特性,這是由于它決定了吸收測量中所用的波長--普通分光光度計(jì)的帶寬為5~10nm,用于研究的儀器的帶寬小于因?yàn)楣鈻艎A縫的寬度影響著帶寬,帶寬隨光柵夾縫的寬度的減少而降低,要獲得特定波長下的數(shù)據(jù),盡可能使用zui小的縫寬度.然而,減少了縫寬也會減少到達(dá)監(jiān)測器的光度,降低了信/噪比.縫寬可減少的程度取決于檢測/放大系統(tǒng)的靈敏度及穩(wěn)定性于離散光的存在.

    大多數(shù)UV/可見光分光光度計(jì)使用的比色杯的光穿過路徑為10nm.一次性塑料杯適合于對水和乙醇溶液在可見光范圍內(nèi)的測量.玻璃比色杯的生產(chǎn)要求更加嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn),因而在研究中要使用玻璃比色杯,尤其當(dāng)溶液的吸收值很低時(shí)(<0.1),即使盛對照液與待測樣品液的比色杯在光學(xué)性質(zhì)上有稍許不同,也會導(dǎo)致結(jié)果偏差.玻璃和塑料會吸收UV光,因此在測波長小于300nm的吸收值時(shí)要使用石英杯.

    進(jìn)行測量之前,比色杯要保證干凈,無劃痕,外表面干燥,盛液到適當(dāng)高度,并放在了比色槽中的正確位置.生物樣品中蛋白質(zhì)和核酸可能會在玻璃/石英杯的內(nèi)表面沉積,因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯內(nèi)的沉淀或用1mol/L硝酸浸泡過后.腐蝕性及毒性溶液必須使用有蓋子的比色杯,以防止濺出,破壞儀器.

     基本分光光度計(jì)使用的光電管類似于比色計(jì)中所使用的光電管.許多情況下,當(dāng)波長高于和低于550~600nm時(shí)必須使用不同的光電管,這是因?yàn)樗鼈冊诳梢姽獠ㄩL內(nèi)的靈敏度不同,更精彩的儀器中所使用的是具有比光電管更高的靈敏度和穩(wěn)定性的檢測器.數(shù)字顯示由于不易產(chǎn)生視覺錯誤和誤讀范圍的錯誤,正逐漸代替指針讀數(shù).一些儀器可以直接給出所測定物質(zhì)的濃度.

紫外光/可見光分光光度計(jì)的類型:

   基本分光光度計(jì)只產(chǎn)生單束光.這種儀器首先用空白對照調(diào)到零吸收值,然后取出空白液,加入待測液,測定待測液的吸收值.也有一種雙束分光光度計(jì),有單色光源產(chǎn)生的光束被分為兩束,一束穿過待測液,另一束穿過空白液.吸收值由一個電子線路通過對比透過待測液及空白液的出射光進(jìn)行測定.雙光束分光光度計(jì)減少了由于光源輸出的不穩(wěn)定或檢測系統(tǒng)靈敏度的變化而導(dǎo)致的測量錯誤,這時(shí)由于待測液與對照液是同時(shí)進(jìn)行測量的.記錄式分光光度計(jì)是一種雙束測定儀,用于記錄已知波段下吸收值隨時(shí)間的變化(如用于酶分析).

分光光度計(jì)的定量分析:

     假如已知一種物質(zhì)在某一波長下的吸光率(通常是該物質(zhì)的zui大吸收值,這時(shí)靈敏度zui高),這種物質(zhì)純?nèi)芤旱臐舛瓤捎帽葼?朗伯關(guān)系式算出.摩爾吸光系數(shù)是指物質(zhì)在1mol/L的濃度下,比色杯厚度為1cm時(shí)的吸收值.該值可以從光譜數(shù)據(jù)表中查到,也可以用實(shí)驗(yàn)方法通過測量一系列已知濃度的物質(zhì)的吸收值來繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線.這樣,在所要求的濃度范圍內(nèi),便可確定吸收值與濃度之間存在的線性關(guān)系,該直線的斜率即為摩爾吸光系數(shù)。

    比吸光率是指物質(zhì)質(zhì)量溶液濃度為10g/L時(shí),比色杯厚度為1cm時(shí)測定的吸光值.該值對于未知分子質(zhì)量的物質(zhì)如蛋白質(zhì)核酸的測定很有用,這種情況下溶液中物質(zhì)的含量以其質(zhì)量表示而不用摩爾濃度表示.使用公式Log10(Io/I)=εl[C]時(shí),比吸光率要除以10才可以得到一個以g/L為單位的濃度值。

    這種簡單的方法不能用于測定混合樣品.在這種情況下,也許可以通過測量幾個波長下的吸光度來估算每種成分的含量,如可用此方法在核酸存在下進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的估算。

分光光度計(jì)的使用方法:

(1)接通電源;(2)使用前預(yù)熱15min;(3)選擇波長;(4)選擇檢測器;(5)如果可能的話,選擇正確的縫寬;(6)插入適當(dāng)?shù)目瞻讓φ?(7)調(diào)解到0%的透過率;(8)將吸光值調(diào)到零;(9)分析樣品;(10)每測量10個樣品后,用空白對照校驗(yàn)零刻度;(11)檢測儀器的可重復(fù)性.